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Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Departamento de Ciências, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalunha, Espanha * Esses autores têm alguns insights sobre este trabalho Equal contribuição background: O ácido hialurônico (AH) é um polissacarídeo de ocorrência natural utilizado na produção de preenchedores dérmicos para fins estéticos.Como tem uma meia-vida de vários dias nos tecidos humanos, os preenchedores dérmicos à base de HA são modificados quimicamente para prolongar sua vida no corpo.A modificação mais comum em cargas comerciais à base de HA é o uso de éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (BDDE) como agente de reticulação para reticular as cadeias de HA.BDDE residual ou não reagido é considerado não tóxico em <2 partes por milhão (ppm);portanto, o BDDE residual no preenchimento dérmico final deve ser quantificado para garantir a segurança do paciente.Materiais e métodos: Este estudo descreve a detecção e caracterização de um subproduto da reação de reticulação entre BDDE e HA em condições alcalinas, combinando cromatografia líquida e espectrometria de massa (LC-MS).Resultados: Após diferentes análises, verificou-se que as condições alcalinas e a alta temperatura utilizadas para desinfetar o hidrogel HA-BDDE promoveram a formação deste novo subproduto, o composto “propilenoglicol-like”.A análise de LC-MS confirmou que o subproduto tem a mesma massa monoisotópica que o BDDE, um tempo de retenção diferente (tR) e um modo de absorbância UV diferente (λ = 200 nm).Ao contrário do BDDE, observou-se na análise LC-MS que, nas mesmas condições de medição, esse subproduto apresenta maior taxa de detecção em 200 nm.Conclusão: Esses resultados indicam que não há epóxido na estrutura deste novo composto.A discussão está aberta para avaliar o risco desse novo subproduto encontrado na produção do hidrogel HA-BDDE (preenchimento dérmico HA) para fins comerciais.Palavras-chave: ácido hialurônico, preenchimento dérmico HA, ácido hialurônico reticulado, BDDE, análise LC-MS, subproduto BDDE.
Preenchimentos à base de ácido hialurônico (AH) são os preenchimentos dérmicos mais comuns e populares usados para fins cosméticos.1 Esse preenchimento dérmico é um hidrogel, geralmente composto por >95% de água e 0,5-3% de HA, o que lhes confere uma estrutura semelhante a gel.2 HA é um polissacarídeo e o principal componente da matriz extracelular de vertebrados.Um dos ingredientes.Consiste em unidades de dissacarídeos repetidas de ácido (1,4)-glucurônico-β (1,3)-N-acetilglucosamina (GlcNAc) conectadas por ligações glicosídicas.Este padrão de dissacarídeo é o mesmo em todos os organismos.Em comparação com alguns enchimentos à base de proteínas (como colágeno), essa propriedade torna o HA uma molécula altamente biocompatível.Esses enchimentos podem apresentar especificidade de sequência de aminoácidos que pode ser reconhecida pelo sistema imunológico do paciente.
Quando usado como preenchedor dérmico, a principal limitação do AH é sua rápida renovação nos tecidos devido à presença de uma família específica de enzimas chamadas hialuronidases.Até agora, várias modificações químicas na estrutura do HA foram descritas para aumentar a meia-vida do HA nos tecidos.3 A maioria dessas modificações tenta reduzir o acesso da hialuronidase aos polímeros polissacarídeos por meio da reticulação das cadeias de HA.Portanto, devido à formação de pontes e ligações covalentes intermoleculares entre a estrutura do HA e o agente de reticulação, o hidrogel de HA reticulado produz mais produtos de degradação antienzimática do que o HA natural.4-6
Até agora, os agentes químicos de reticulação usados para produzir HA reticulado incluem metacrilamida, 7 hidrazida, 8 carbodiimida, 9 divinil sulfona, 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE) e poli(etileno glicol) diglicidil éter.10 ,11 BDDE é atualmente o agente de reticulação mais comumente usado.Embora esses tipos de hidrogéis tenham se mostrado seguros há décadas, os agentes de reticulação utilizados são reagentes reativos que podem ser citotóxicos e, em alguns casos, mutagênicos.12 Portanto, seu teor residual no hidrogel final deve ser alto.O BDDE é considerado seguro quando a concentração residual é inferior a 2 partes por milhão (ppm).4
Existem vários métodos para detectar concentração de BDDE de baixo resíduo, grau de reticulação e posição de substituição em hidrogéis de HA, como cromatografia gasosa, cromatografia de exclusão de tamanho acoplada a espectrometria de massa (MS), métodos de medição de fluorescência por ressonância magnética nuclear (RMN) e Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada com arranjo de diodos.13-17 Este estudo descreve a detecção e caracterização de um subproduto no hidrogel final de HA reticulado produzido pela reação de BDDE e HA em condições alcalinas.HPLC e cromatografia líquida-espectrometria de massa (análise LC-MS).Como a toxicidade deste subproduto do BDDE é desconhecida, recomendamos que sua quantificação de resíduos seja determinada de forma semelhante ao método usualmente realizado no BDDE no produto final.
O sal de sódio de HA obtido (Shiseido Co., Ltd., Tóquio, Japão) tem um peso molecular de ~1.368.000 Da (método Laurent) 18 e uma viscosidade intrínseca de 2,20 m3/kg.Para a reação de reticulação, o BDDE (≥95%) foi adquirido da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA).A solução salina tamponada com fosfato com pH 7,4 foi adquirida da Sigma-Aldrich Company.Todos os solventes, acetonitrila e água usados na análise LC-MS foram adquiridos da qualidade de grau HPLC.O ácido fórmico (98%) é adquirido como grau de reagente.
Todos os experimentos foram realizados em um sistema UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, EUA) e conectado a um espectrômetro de massa triplo quadrupolo API 3000 equipado com uma fonte de ionização por eletrospray (AB SCIEX, Framingham, MA, EUA).
A síntese de hidrogéis de HA reticulados foi iniciada pela adição de 198 mg de BDDE a uma solução de hialuronato de sódio (NaHA) a 10% (p/p) na presença de álcali a 1% (hidróxido de sódio, NaOH).A concentração final de BDDE na mistura de reação foi de 9,9 mg/mL (0,049 mM).Em seguida, a mistura de reação foi completamente misturada e homogeneizada e deixada prosseguir a 45°C por 4 horas.19 O pH da reação é mantido em ~12.
Em seguida, a mistura de reação foi lavada com água e o hidrogel HA-BDDE final foi filtrado e diluído com tampão PBS para atingir uma concentração de HA de 10 a 25 mg/mL e um pH final de 7,4.Para esterilizar os hidrogéis de HA reticulados produzidos, todos esses hidrogéis são autoclavados (120°C por 20 minutos).O hidrogel BDDE-HA purificado é armazenado a 4°C até a análise.
Para analisar o BDDE presente no produto de HA reticulado, uma amostra de 240 mg foi pesada e introduzida no orifício central (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, EUA; volume 0,5 mL) e centrifugada a 10.000 rpm em temperatura ambiente 10 minutos.Um total de 20 µL de líquido suspenso foi coletado e analisado.
Para analisar o padrão BDDE (Sigma-Aldrich Co) sob condições alcalinas (1%, 0,1% e 0,01% NaOH), se as seguintes condições forem atendidas, a amostra líquida é 1:10, 1:100 ou até 1:1.000.000 Se necessário, use água desionizada MilliQ para análise.
Para os materiais de partida usados na reação de reticulação (HA 2%, H2O, 1% NaOH e 0,049 mM BDDE), 1 mL de cada amostra preparada a partir desses materiais foi analisado usando as mesmas condições de análise.
Para determinar a especificidade dos picos que aparecem no mapa de íons, 10 µL de 100 ppb de solução padrão BDDE (Sigma-Aldrich Co) foram adicionados à amostra de 20 µL.Neste caso, a concentração final do padrão em cada amostra é de 37 ppb.
Primeiro, prepare uma solução estoque de BDDE com uma concentração de 11.000 mg/L (11.000 ppm) diluindo 10 μL de BDDE padrão (Sigma-Aldrich Co) com 990 μL de água MilliQ (densidade 1,1 g/mL).Use esta solução para preparar uma solução de BDDE de 110 µg/L (110 ppb) como uma diluição padrão intermediária.Em seguida, use o diluente padrão BDDE intermediário (110 ppb) para preparar a curva padrão diluindo o diluente intermediário várias vezes para atingir a concentração desejada de 75, 50, 25, 10 e 1 ppb.Conforme mostrado na Figura 1, verifica-se que a curva padrão BDDE de 1,1 a 110 ppb tem boa linearidade (R2>0,99).A curva padrão foi repetida em quatro experimentos independentes.
Figura 1 Curva de calibração padrão BDDE obtida pela análise LC-MS, na qual se observa uma boa correlação (R2>0,99).
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidílico de 1,4-butanodiol;LC-MS, cromatografia líquida e espectrometria de massa.
Para identificar e quantificar os padrões BDDE presentes no HA reticulado e os padrões BDDE na solução base, foi utilizada a análise LC-MS.
A separação cromatográfica foi realizada em coluna LUNA 2,5 µm C18(2)-HST (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, EUA) e mantida à temperatura ambiente (25°C) durante a análise.A fase móvel consiste em acetonitrila (solvente A) e água (solvente B) contendo 0,1% de ácido fórmico.A fase móvel é eluída por eluição em gradiente.O gradiente é o seguinte: 0 minutos, 2% A;1 minuto, 2% A;6 minutos, 98% A;7 minutos, 98% A;7,1 minutos, 2% A;10 minutos, 2% A. O tempo de execução é de 10 minutos e o volume de injeção é de 20 µL.O tempo de retenção do BDDE é de cerca de 3,48 minutos (variando de 3,43 a 4,14 minutos com base em experimentos).A fase móvel foi bombeada a uma taxa de fluxo de 0,25 mL/min para análise LC-MS.
Para análise e quantificação de BDDE por MS, o sistema UPLC (Waters) é combinado com um espectrômetro de massa triplo quadrupolo API 3000 (AB SCIEX) equipado com uma fonte de ionização por eletrospray, e a análise é realizada no modo de íons positivos (ESI+).
De acordo com a análise de fragmentos iônicos realizada em BDDE, o fragmento com maior intensidade foi determinado como sendo o fragmento correspondente a 129,1 Da (Figura 6).Portanto, no modo de monitoramento multi-íon (MIM) para quantificação, a conversão de massa (razão massa-carga [m/z]) de BDDE é 203,3/129,1 Da.Ele também usa o modo de varredura completa (FS) e o modo de varredura de íons do produto (PIS) para análise LC-MS.
Para verificar a especificidade do método, foi analisada uma amostra em branco (fase móvel inicial).Nenhum sinal foi detectado na amostra em branco com uma conversão de massa de 203,3/129,1 Da.Em relação à repetibilidade do experimento, foram analisadas 10 injeções padrão de 55 ppb (no meio da curva de calibração), resultando em um desvio padrão residual (RSD) <5% (dados não apresentados).
O teor de BDDE residual foi quantificado em oito diferentes hidrogéis de HA reticulados de BDDE autoclavados, correspondendo a quatro experimentos independentes.Conforme descrito na seção “Materiais e Métodos”, a quantificação é avaliada pelo valor médio da curva de regressão da diluição padrão BDDE, que corresponde ao pico único detectado na transição de massa BDDE de 203,3/129,1 Da, com retenção tempo de 3,43 a 4,14 minutos Sem espera.A Figura 2 mostra um exemplo de cromatograma do padrão de referência BDDE de 10 ppb.A Tabela 1 resume o teor de BDDE residual de oito hidrogéis diferentes.O intervalo de valores é de 1 a 2,46 ppb.Portanto, a concentração residual de BDDE na amostra é aceitável para uso humano (<2 ppm).
Figura 2 Cromatograma de íons de padrão de referência BDDE de 10 ppb (Sigma-Aldrich Co), transição MS (m/z) obtido por análise LC-MS de 203,30/129,10 Da (no modo MRM positivo).
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidílico de 1,4-butanodiol;LC-MS, cromatografia líquida e espectrometria de massa;MRM, monitoramento de reações múltiplas;MS, massa;m/z, razão massa-carga.
Nota: As amostras 1-8 são hidrogéis de HA reticulados BDDE autoclavados.A quantidade residual de BDDE no hidrogel e o pico do tempo de retenção de BDDE também são relatados.Por fim, também é relatada a existência de novos picos com diferentes tempos de retenção.
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidílico de 1,4-butanodiol;HA, ácido hialurônico;MRM, monitoramento de reações múltiplas;tR, tempo de retenção;LC-MS, cromatografia líquida e espectrometria de massa;TRR, tempo de retenção relativo.
Surpreendentemente, a análise do cromatograma de íons LC-MS mostrou que, com base em todas as amostras de hidrogel de HA reticuladas autoclavadas analisadas, houve um pico extra no tempo de retenção mais curto de 2,73 a 3,29 minutos.Por exemplo, a Figura 3 mostra o cromatograma de íons de uma amostra de HA reticulada, onde um pico adicional aparece em um tempo de retenção diferente de aproximadamente 2,71 minutos.O tempo de retenção relativo observado (RRT) entre o novo pico observado e o pico do BDDE foi de 0,79 (Tabela 1).Como sabemos que o novo pico observado é menos retido na coluna C18 usada na análise LC-MS, o novo pico pode corresponder a um composto mais polar que o BDDE.
Figura 3 Cromatograma de íons de amostra de hidrogel de HA reticulada obtida por LC-MS (conversão de massa MRM 203,3/129,0 Da).
Abreviaturas: HA, ácido hialurônico;LC-MS, cromatografia líquida e espectrometria de massa;MRM, monitoramento de reações múltiplas;TRR, tempo de retenção relativo;tR, tempo de retenção.
A fim de descartar a possibilidade de que os novos picos observados possam ser contaminantes originalmente presentes nas matérias-primas utilizadas, essas matérias-primas também foram analisadas usando o mesmo método de análise LC-MS.Os materiais de partida analisados incluem água, 2% de NaHA em água, 1% de NaOH em água e BDDE na mesma concentração usada na reação de reticulação.O cromatograma iônico do material de partida utilizado não apresentou nenhum composto ou pico, e seu tempo de retenção corresponde ao novo pico observado.Este fato descarta a ideia de que não apenas o material de partida possa conter quaisquer compostos ou substâncias que possam interferir no procedimento de análise, mas não há indícios de possível contaminação cruzada com outros produtos laboratoriais.Os valores de concentração obtidos após a análise LC-MS de BDDE e novos picos são mostrados na Tabela 2 (amostras 1-4) e o cromatograma de íons na Figura 4.
Nota: As amostras 1-4 correspondem às matérias-primas usadas para produzir hidrogéis de HA reticulados BDDE autoclavados.Estas amostras não foram autoclavadas.
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidílico de 1,4-butanodiol;HA, ácido hialurônico;LC-MS, cromatografia líquida e espectrometria de massa;MRM, monitoramento de reações múltiplas.
A Figura 4 corresponde ao cromatograma LC-MS de uma amostra da matéria-prima utilizada na reação de reticulação de HA e BDDE.
Nota: Todos estes são medidos na mesma concentração e proporção usada para realizar a reação de reticulação.Os números das matérias-primas analisadas pelo cromatograma correspondem a: (1) água, (2) solução aquosa de HA a 2%, (3) solução aquosa de NaOH a 1%.A análise LC-MS é realizada para conversão de massa de 203,30/129,10 Da (no modo MRM positivo).
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidílico de 1,4-butanodiol;HA, ácido hialurônico;LC-MS, cromatografia líquida e espectrometria de massa;MRM, monitoramento de reações múltiplas.
As condições que levaram à formação de novos picos foram estudadas.A fim de estudar como as condições de reação usadas para produzir o hidrogel de AH reticulado afetam a reatividade do agente de reticulação BDDE, levando à formação de novos picos (possíveis subprodutos), diferentes medições foram realizadas.Nessas determinações, estudamos e analisamos o reticulante BDDE final, que foi tratado com diferentes concentrações de NaOH (0%, 1%, 0,1% e 0,01%) em meio aquoso, seguido ou sem autoclavagem.O procedimento das bactérias para simular as mesmas condições é o mesmo que o método usado para produzir o hidrogel de HA reticulado.Conforme descrito na seção “Materiais e Métodos”, a transição de massa da amostra foi analisada por LC-MS para 203,30/129,10 Da.O BDDE e a concentração do novo pico são calculados, e os resultados são mostrados na Tabela 3. Não foram detectados novos picos nas amostras que não foram autoclavadas, independentemente da presença de NaOH na solução (amostras 1-4, Tabela 3).Para amostras autoclavadas, novos picos são detectados apenas na presença de NaOH na solução, e a formação do pico parece depender da concentração de NaOH na solução (amostras 5-8, Tabela 3) (RRT = 0,79).A Figura 5 mostra um exemplo de cromatograma de íons, mostrando duas amostras autoclavadas na presença ou ausência de NAOH.
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidílico de 1,4-butanodiol;LC-MS, cromatografia líquida e espectrometria de massa;MRM, monitoramento de reações múltiplas.
Nota: O cromatograma superior: A amostra foi tratada com solução aquosa de NaOH a 0,1% e autoclavada (120°C por 20 minutos).Cromatograma inferior: A amostra não foi tratada com NaOH, mas autoclavada nas mesmas condições.A conversão de massa de 203,30/129,10 Da (no modo MRM positivo) foi analisada por LC-MS.
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidílico de 1,4-butanodiol;LC-MS, cromatografia líquida e espectrometria de massa;MRM, monitoramento de reações múltiplas.
Em todas as amostras autoclavadas, com ou sem NaOH, a concentração de BDDE foi bastante reduzida (até 16,6 vezes) (amostras 5-8, Tabela 2).A diminuição na concentração de BDDE pode ser devido ao fato de que em altas temperaturas, a água pode atuar como uma base (nucleófila) para abrir o anel epóxido do BDDE para formar um composto 1,2-diol.A qualidade monoisotópica deste composto é diferente da do BDDE e, portanto, não será afetada.LC-MS detectou um deslocamento de massa de 203,30/129,10 Da.
Por fim, esses experimentos mostram que a geração de novos picos depende da presença de BDDE, NAOH e do processo de autoclavagem, mas não tem nada a ver com HA.
O novo pico encontrado em um tempo de retenção de aproximadamente 2,71 minutos foi então caracterizado por LC-MS.Para isso, BDDE (9,9 mg/mL) foi incubado em solução aquosa de NaOH a 1% e autoclavado.Na Tabela 4, as características do novo pico são comparadas com o conhecido pico de referência BDDE (tempo de retenção de aproximadamente 3,47 minutos).Com base na análise da fragmentação iônica dos dois picos, pode-se concluir que o pico com tempo de retenção de 2,72 minutos apresenta os mesmos fragmentos do pico BDDE, mas com intensidades diferentes (Figura 6).Para o pico correspondente ao tempo de retenção (PIS) de 2,72 minutos, observou-se um pico mais intenso após a fragmentação na massa de 147 Da.Na concentração de BDDE (9,9 mg/mL) utilizada nesta determinação, diferentes modos de absorbância (UV, λ=200 nm) no espectro ultravioleta também foram observados após separação cromatográfica (Figura 7).O pico com tempo de retenção de 2,71 minutos ainda é visível em 200 nm, enquanto o pico BDDE não pode ser observado no cromatograma nas mesmas condições.
Tabela 4 Resultados de caracterização do novo pico com tempo de retenção de cerca de 2,71 minutos e do pico BDDE com tempo de retenção de 3,47 minutos
Nota: Para obter estes resultados, foram realizadas análises LC-MS e HPLC (MRM e PIS) nos dois picos.Para análise de HPLC, a detecção UV com comprimento de onda de 200 nm é usada.
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidílico de 1,4-butanodiol;HPLC, cromatografia líquida de alta eficiência;LC-MS, cromatografia líquida e espectrometria de massa;MRM, monitoramento de reações múltiplas;m/z, razão massa/carga;PIS, varredura de íons do produto;luz ultravioleta, luz ultravioleta.
Nota: Os fragmentos de massa são obtidos por análise LC-MS (PIS).Cromatograma superior: espectro de massa de fragmentos de amostra padrão BDDE.Cromatograma inferior: O espectro de massa do novo pico detectado (RRT associado ao pico BDDE é 0,79).O BDDE foi processado em solução de NaOH a 1% e autoclavado.
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidílico de 1,4-butanodiol;LC-MS, cromatografia líquida e espectrometria de massa;MRM, monitoramento de reações múltiplas;PIS, varredura de íons do produto;TRR, tempo de retenção relativo.
Figura 7 Cromatograma de íons do íon precursor de 203,30 Da, e (A) o novo pico com um tempo de retenção de 2,71 minutos e (B) a detecção UV do pico padrão de referência BDDE em 3,46 minutos a 200 nm.
Em todos os hidrogéis de HA reticulados produzidos, observou-se que a concentração residual de BDDE após a quantificação por LC-MS era <2 ppm, mas um novo pico desconhecido apareceu na análise.Este novo pico não corresponde ao produto padrão BDDE.O produto padrão BDDE também passou pela mesma análise de conversão de qualidade (conversão MRM 203,30/129,10 Da) no modo MRM positivo.Geralmente, outros métodos analíticos, como cromatografia, são usados como testes de limite para detectar BDDE em hidrogéis, mas o limite máximo de detecção (LOD) é ligeiramente inferior a 2 ppm.Por outro lado, até agora, NMR e MS têm sido usados para caracterizar o grau de reticulação e/ou modificação de HA nos fragmentos de unidades de açúcar de produtos de HA reticulados.O objetivo dessas técnicas nunca foi quantificar a detecção de BDDE residual em concentrações tão baixas como descrevemos neste artigo (LOD do nosso método LC-MS = 10 ppb).
Hora da postagem: Set-01-2021